基于GenoLab M的新冠研究多方案测评
时间:
2021-10-20
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自2019年底新冠疫情爆发以来,海外疫情还在不断持续和蔓延,国内疫情偶有发生,多为境外输入或与之相关。根据美国约翰斯·霍普金斯大学发布的新冠疫情最新统计数据,截至2021年10月17日上午8点,全球累计新冠确诊病例近2.4亿例,累计死亡病例超过480万例。

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图1 全球新冠疫情统计数据

(数据来源:https://coronavirus.jhu.edu/map.html)


新冠病毒是一种单链RNA病毒,核酸序列总长约30Kb(不同毒株,长度略有不同)。由于新冠病毒一直在不断变异进化,世卫组织根据病毒株发现时间的先后顺序,依次使用希腊字母对其命名。如:Alpha(α)、Beta(β)、Gamma(γ)、Delta(δ)、Lambda(λ)等,目前,Delta和Lambda为主流毒株。

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图2 新冠病毒进化演变

(数据来源:https://nextstrain.org/ncov/gisaid/global)


至今,全球公开的新冠病毒序列已经超过87万条,当疫情爆发,第一时间破解病毒全基因组序列,持续监测毒株变异,明确毒株分型,对锁定传染源、控制传播途径和疫苗研发等都至关重要。

目前,市面上多家公司推出了基于多重PCR扩增获得新冠病毒基因组全长序列的检测试剂盒威尼斯游戏网站,我们挑选了其中5款使用GenoLab M高通量基因测序平台对其检测性能进行评估。



01

 测试总方案


本次测试采用Synthetic SARS-CoV-2 RNA质控品(Twist,货号104533)作为模拟样本,分组如下:


RNA组:梯度稀释的Synthetic SARS-CoV-2 RNA质控品;


RNA拭子组:梯度稀释的Synthetic SARS-CoV-2 RNA质控品加入咽拭子人源RNA。


我们对Ct值17-38的RNA组及RNA拭子组样本进行测序与数据分析以评估各试剂盒的检测灵敏度和阳性预测值。

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表1 测试总方案

注:采用C试剂盒对模拟样本进行多重PCR完成目标区域的捕获,其捕获产物分别搭配了两种不同品牌的转座酶快速建库试剂盒(C-1、C-2)来完成建库


本次测试中主要包含了两种不同的威尼斯游戏网站路线:

多重PCR捕获+PCR建库:采用一轮多重PCR来完成目标区域的捕获,其捕获产物通过第二轮的PCR扩增加上测序接头来完成文库构建(A、B试剂盒,见表1);


多重PCR捕获+酶切建库:采用一轮多重PCR来完成目标区域的捕获,其捕获产物通过转座法或酶切连接法来完成文库的构建(C-1、C-2、GM-LDT试剂盒,见表1)。


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图3 威尼斯游戏网站路线



02

 测试结果展示


下机数据分析及检测限

对不同试剂盒的RNA组样本及RNA 拭子组样本(Ct值17-38)的GenoLab M平台测序结果进行测序质量、基因组覆盖度、100×覆盖度比例等参数的分析对比,根据“100×覆盖度比例≥90%”确定本次测试的检测限。

结果表明:


A试剂盒的两组模拟样本的检测限均为Ct 34.25;

B试剂盒的RNA组样本的检测结果均未能满足100×覆盖度比例≥90%,RNA拭子组样本的检测限为Ct 28.07;

C-1试剂盒RNA组检测限为Ct 30.28,RNA拭子组检测限为Ct 28.43;

C-2试剂盒RNA组检测限为Ct 32.81,RNA拭子组检测限为Ct 29.46;

GM-LDT试剂盒RNA组检测为Ct 33.88,RNA拭子组检测限为Ct 35.93。


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注:RNA拭子组中Ct 34.25样本的比对率为54.98%,其中98.08%的unmapped reads比对到人的参考序列上


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表2 Genolab M测序数据分析

注:在计算基因组覆盖度及100×覆盖度比例时,由于Synthetic SARS-CoV-2 RNA质控品是由6个RNA片段组成(断点位置:5K、10K、15K、20K、25K),断点区域的扩增效果差,因此导致覆盖度比例会相应降低


通过以上对比可知,A、C-1、C-2、GM-LDT 试剂盒在低病毒载量样本(~Ct 30)中均能较好的满足“100×覆盖度比例≥90%”。当存在人源RNA干扰时,B试剂盒RNA组与RNA拭子组样本测试数据差异较大,可能人源RNA的存在对其试剂盒的性能有较大的影响。C-1试剂盒与C-2试剂盒的性能相当。


基因组覆盖均一性

综合比较各试剂盒RNA组和RNA拭子组Ct值的中值[1]和检测限值(Ct值26.5-35.93)测试数据的基因组覆盖均一性,如下图所示,C-1、C-2、GM-LDT 试剂盒的基因组覆盖均一性优于A试剂盒和B试剂盒。

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图4 基因组覆盖均一性


灵敏度与阳性预测值

如下表所示,A、C-1、C-2、GM-LDT试剂盒在中值组中的检测灵敏度与阳性预测值均大于90%,在检测限组,除A试剂盒外,C-1、C-2、GM-LDT 试剂盒的检测灵敏度与阳性预测值均大于90%。相比之下,B试剂盒的检测灵敏度与阳性预测值相对较差。

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表3 灵敏度与阳性预测值

注:Synthetic SARS-CoV-2 RNA质控品中含有30个阳性位点


进化分析

基于A、B、C-1、C-2、GM-LDT 试剂盒的测序数据构建进化树。结果如下图所示,几款试剂盒检测的结果与Synthetic SARS-CoV-2 RNA质控品能准确的聚类到一个分支,且C和GM-LDT结果与质控品距离最近。

↓↓↓向下滑动查看进化树↓↓↓

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性能比较

综合比较A、B、C-1、C-2、GM-LDT 试剂盒的检测限值数据,其结果详情如下:

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03

 真迈新冠基因组全长测序整体解决方案


基于GenoLab M高通量测序平台,真迈生物重磅推出“新冠基因组全长测序整体解决方案”。该解决方案涵盖了样本提取、建库、测序、分析全流程,可威尼斯游戏网站于新冠病毒的全基因组的组装、变异检测、进化研究等,还可以威尼斯游戏网站于二次复核确诊和大规模疑似样本检测。

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